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本課題探討血管內皮生長抑制因子（VEGI-192）的結構和功能學關系，首次發(fā)現(xiàn)VEGI-192蛋白具有形成多聚體空間結構的特性；通過體內、體外抗血管新生實驗，證明了VEGI-192蛋白多聚體的結構形式可能為其生物學活性形式；同時以整合素αvβ3為腫瘤靶點，RGD-4C肽為腫瘤靶向載體，VEGI-192蛋白為抗腫瘤效應分子，成功構建靶向性抗腫瘤融合蛋白RGD-VEGI-192。

本課題組成員自2008年開始研究一種更加高效穩(wěn)定的蛋白表達系統(tǒng)和純化復性方法，目前已成功建立VEGI-192蛋白的新型自動誘導原核表達系統(tǒng)及蛋白制備新工藝，并能高效穩(wěn)定地表達高產量、高純度、高活性及可溶性好的VEGI-192重組蛋白。因為本系統(tǒng)自身的獨特設計，可以為重組蛋白在宿主菌中提供均衡氧化還原勢能，以利于蛋白的正確空間折疊，應用該自動誘導系統(tǒng)表達的VEGI-192重組蛋白在產量、可溶性、活性等方面均明顯優(yōu)于傳統(tǒng)IPTG誘導表達系統(tǒng)。而在蛋白純化過程中，通過Western blotting檢測方法比較兩個系統(tǒng)獲得的VEGI-192重組蛋白條帶的異同，我們發(fā)現(xiàn)自誘導系統(tǒng)存在的豐富的多聚體形態(tài)，于是，我們提出一個假設：VEGI-192蛋白具有形成多聚體空間結構的特性，并且研究證明這種多聚體的結構形式可能為其生物學活性形式。

我們發(fā)現(xiàn)，進行非還原SDS-PAGE后再進行Western Blotting檢測來進一步分析鑒定自誘導表達系統(tǒng)純化的VEGI-192蛋白，有兩條蛋白條帶清晰可見，我們推測這很可能便是VEGI-192的多聚體條帶。為了進一步驗證排除非特異條帶的可能性，我們充分煮沸使VEGI-192變性后再次進行Western Blotting分析，結果顯示無多聚體蛋白條帶，這從一方面面證明了VEGI-192存在多聚體的結構形式。同時，我們將VEGI-192用非還原SDS-PAGE后再進行考馬斯亮藍染色，切下處于上方的多聚體條帶作質譜分析，結果顯示該條帶即為VEGI-192蛋白，這充分證明了VEGI-192存在多聚體的結構形式。目前我們正開展對VEGI-192蛋白的結晶實驗，擬進行X-射線晶體衍射實驗對其多聚體結構進行更為詳盡的鑒定。

我們發(fā)現(xiàn)了自誘導系統(tǒng)制備的重組蛋白的多聚體量更多，進而通過采用MTT比色試驗法和Annexin V細胞染色分析結合流式細胞術檢測VEGI-192重組蛋白在不同多聚體形態(tài)下的體外抑制內皮細胞增殖及誘導細胞凋亡的生物學活性。同時應用雞胚絨毛尿囊血管新生抑制實驗測定兩者體內抑制血管新生活性，我們發(fā)現(xiàn)多聚體含量越高的VEGI-192重組蛋白其抗血管新生的生物學活性更強。這充分證明VEGI-192蛋白形成的多聚體的空間結構可能為其生物學活性形式。

同時在VEGI-192蛋白的結構改造與修飾方面，我們引入RGD多肽與VEGI-192形成嵌合蛋白，擬探討RGD的嵌合改造是否能增強VEGI-192的功效。RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽，作為整合素和其配體相互作用的識別位點, 介導細胞與細胞外基質及細胞之間的相互作用。腫瘤細胞或者新生血管可以特異表達某些整合素如αvβ3，能以一定的親和力結合RGD肽,成為腫瘤治療的新靶點。因此,RGD 肽在腫瘤治療中的應用已成為研究熱點。RGD肽可以誘導腫瘤細胞凋亡而且作為載體在腫瘤靶向治療中發(fā)揮重要作用。而目前在VEGI蛋白的三維立體結構、作用機理和藥理學性質沒有完整清晰的了解的情況下，我們擬構建靶向性更強的嵌合重組蛋白RGD-VEGI-192，以整合素αvβ3為腫瘤靶點，RGD-4C肽為腫瘤靶向載體，VEGI-192蛋白為抗腫瘤效應分子，構建靶向性抗腫瘤融合蛋白RGD-VEGI-192，并檢測其生物學活性，為深入探討RGD-VEGI-192的體內靶向抑瘤活性及腫瘤治療應用前景奠定基礎。同時豐富了VEGI-192在腫瘤治療中的應用形式，為腫瘤靶向治療提供了新思路。

第十二屆“挑戰(zhàn)杯”作品 一等獎
1.本論文部分結果已發(fā)表于SCI雜志《Protein Science》，影響因子2.9，本課題組成員劉漢凝同學為共同第一作者。
2.本課題組構建的VEGI-192蛋白的新型自動誘導原核表達系統(tǒng)及蛋白制備新工藝的專利申請已獲國家知識產權局予以受理，申請?zhí)枮?00910037702.6。
3.本課題組構建的靶向性抗腫瘤融合蛋白RGD-VEGI-192表達克隆專利申請已獲國家知識產權局予以受理，申請?zhí)枮?00910037701.1。
4.本作品獲我校第十一屆“挑戰(zhàn)杯”大學生課外學術作品大賽一等獎。
5.本作品獲廣東省第十一屆“挑戰(zhàn)杯”大學生課外學術作品大賽特等獎。